国家自然科技资源平台不同生物安全级别微生物菌种操作规程（试行）
《自然科技资源收集整理保存技术规程研究制定》项目组
二〇〇四年十二月十日
目 次
前 言…………………………………………………………………………………………2
引 言…………………………………………………………………………………………3
1 范围………………………………………………………………………………………4
2 规范性引用文件…………………………………………………………………………4
3 术语、定义、符号、缩写语…………………………………………………………………4
4 确定微生物的危害等级时必须考虑的因素……………………………………………6
4.1 微生物本身的致病特征…………………………………………………………………6
4.2 其它因素…………………………………………………………………………………6
5. 微生物实验室生物安全防护的基本原则………………………………………………6
6. 不同生物安全级别微生物菌种操作规程………………………………………………6
6.1 生物安全等级Ⅰ级微生物菌种操作规程…………………………………………6
6.1.2 实验室设计和建造的特殊要求……………………………………………………7
6.2 生物安全等级Ⅱ级微生物菌种操作规程………………………………………………7
6.2.2 特殊要求……………………………………………………………………………8
6.3 生物安全等级Ⅲ级微生物菌种操作规程…………………………………………9
6.4 生物安全等级Ⅳ级微生物菌种操作规程…………………………………………10
前 言
本规程由自然科技资源平台建设项目提出。
本规程起草单位：中国农业科学院土壤肥料研究所、中国兽医药品监察所、中国科学院微生物研究所、中国林业科学研究院森林保护研究所、中国药品生物制品检定所、中国医学科学院医药生物技术研究所、中国食品发酵工业研究院。
本规程主要起草人：叶强、姜瑞波、顾金刚、周宇光、朴春根、张月琴、陈敏、程池等。
引 言
微生物可根据其自身或其所产生的毒素的危害程度分为四个不同的生物安全等级。对健康成年人（动物）已知无致病作用的微生物的生物安全级别为一级；对人（动物）或环境具有中等潜在危害的微生物的生物安全级别为二级；主要通过呼吸途径使人（动物）传染上严重的甚至是致死疾病的致病微生物（通常已有预防传染的疫苗）的生物安全级别为三级；对人体（动物）具有高度的危险性，通过气溶胶途径传播或传播途径不明，目前尚无有效的疫苗或治疗方法的致病微生物的生物安全级别为四级。
不同生物安全级别微生物菌种的操作，如分离、培养、鉴定和保藏，应在相应生物安全防护的条件下进行。本规范根据当前国家自然科技资源平台建设的总体要求，结合微生物菌种资源的特点制定，便于在微生物菌种资源的收集、保存、鉴定、评价、研究和利用过程中，尽量避免环境和人员受到微生物本身及其代谢产物的危害，实现菌种资源的高效共享和可持续利用。
不同生物安全级别微生物菌种操作规程
1 范围
本规程规定了微生物生物安全分类标准，以及不同生物安全级别防护级别进行微生物的操作规程。
本规程适用于各菌种保藏单位所保藏的菌种资源的操作，如分离、培养、鉴定和保藏。
2 规范性引用文件
下列文件中的条款通过本规范的引用而成为本规范的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改（不包括勘误内容）或修订版均不适用于本规范，然而，鼓励根据本规范达成的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本规范。
《病原微生物实验室生物安全管理条例》（国务院第424条令）
《兽医实验室生物安全管理规范》（2003年农业部302号公告）
WS233-2002 微生物和生物医学实验室生物安全通用准则
OIE 2003 国际动物卫生法典
WHO《实验室生物安全手册》第二版
GB19489-2004《实验室生物安全通用要求》
3 术语、定义、符号、缩写语
3.1一类微生物
对个体和群体危害程度高，通常引起人和/或动物严重疫病且暂无有效的预防和治疗措施的致病微生物。通过气溶胶传播的，有高度传染性、致死性的人和/或动物致病微生物；未知危险的人或动物致病微生物；我国尚未发现或已经宣布消灭的微生物。
3.2二类微生物
对个体危害程度高，对群体危害较高。能通过气溶胶传播引起严重或致死性疫病，导致严重经济损失的致病微生物，或者比较容易直接或间接在人与人、动物与人、动物与动物间传播的微生物。对人引发的疾病具有有效的预防和治疗措施。
3.3三类微生物
对个体危害程度为中度，对群体危害较低，主要通过皮肤、黏膜、消化道传播。对人和/或动物有致病性，但一般对实验人员、动物、环境不会造成严重危害、传播风险有限的致病微生物，具有有效的预防和治疗措施。
3.4四类微生物
对个体和群体危害程度低，通常情况下不会对健康成年人和/或动物致病的微生物。
3.5一级生物安全防护水平
能够安全操作对实验室工作人员和/或动物无明显致病性的，对环境危害程度微小的，特性清楚的病原微生物的生物安全水平。
3.6二级生物安全防护水平
能够安全操作对实验室工作人员和/或动物致病性低的，对环境有轻微危害的病原微生物的生物安全水平。
3.7三级生物安全防护水平
能够安全地从事本国和外来的、具有可能经呼吸道传播以及引起严重的或致死性疾病的、对人引发的疾病具有有效的预防和治疗措施的病原微生物工作的生物安全水平。与上述相近的或有抗原关系的，但尚未完全认知的病原体，也应在此种水平条件下进行操作，只有取得足够的数据后才能确定最后的生物安全水平等级。
3.8四级生物安全防护水平
能够安全地从事从国外传入能通过气溶胶传播，实验室感染高度危险，严重威胁人和或动物生命和危害环境的，没有特效预防和治疗方法的微生物工作的生物安全水平。与上述相近的或有抗原关系的，但尚未完全认知的病原体，也应在此种水平条件下进行操作，只有取得足够的数据后才能确定最后的生物安全水平等级。
3.9 气溶胶 Aerosol
悬浮于气体介质中粒径为0.001-100µm的固体、液体微小粒子形成的胶溶状态分散体系。
3.10生物安全柜 biosafety cabinet
处理危险性微生物时所用的箱形空气净化安全装置。
4 确定微生物的危害等级时必须考虑的因素
4.1 微生物本身的致病特征：
微生物的致病性和毒力；宿主范围；所引起疾病的发病率和死亡率；疾病的传播媒介；动物体内或环境中病原的量和浓度；排出物传播的可能性；病原在自然环境中的存活时间；病原的地方流行特性；交叉污染的可能性；获得有效疫苗、预防和治疗药物的程度。
4.2 其它因素：
产生气溶胶的可能性；操作方法（体外、体内或攻毒）；对重组微生物还应评估其基因特征（毒力基因和毒素基因）、宿主适应性改变、基因整合、增殖力和回复野生型的能力等。
5. 微生物实验室生物安全防护的基本原则
微生物实验室生物安全防护的内容包括安全设备、个体防护装置和措施，实验室的特殊设计和建设要求，严格的管理制度和标准化的操作程序及规程。
6. 不同生物安全级别防护微生物菌种操作规程
6.1 生物安全等级防护Ⅰ级微生物菌种操作规程
6.1.1 安全设备和个体防护
6.1.1.1 一般无须使用生物安全柜等专用安全设备。
6.1.1.2 禁止非工作人员进入实验室。参观实验室等特殊情况须经实验室负责人批准后方可进入。
6.1.1.3 接触微生物或含有微生物的物品后，脱掉手套后和离开实验室前要洗手。
6.1.1.4 禁止在工作区饮食、吸烟、处理隐形眼镜、化妆及储存食物。
6.1.1.5 以移液器吸取液体，禁止口吸。
6.1.1.6 制定尖锐器具的安全操作规程。
6.1.1.7 降低溅出和气溶胶的产生。
6.1.1.8 每天至少消毒一次工作台面，活性物质溅出后要随时消毒。
6.1.1.9 所有培养物、废弃物在运出实验室之前必须进行灭活，如高压灭活。需运出实验室灭活的物品必须放在专用密闭容器内。
6.1.1.10 制定有效的防鼠防虫措施。
6.1.1.11 工作人员在实验时应穿工作服，戴防护眼镜。
6.1.1.12 工作人员手上有皮肤破损或皮疹时应戴手套。
6.1.2 实验室设计和建造的特殊要求
6.1.2.1 每个实验室应设洗手池，宜设置在靠近出口处。
6.1.2.2 实验室围护结构内表面应易于清洁。地面应防滑、无缝隙，不得铺设地毯。
6.1.2.3 实验台表面应不透水，耐腐蚀、耐热。
6.1.2.4 实验室中的家具应牢固并易于清洁。
6.1.2.5 实验室如有可开启的窗户，应设置纱窗。
6.2 生物安全等级II级防护微生物菌种操作规程
6.2.1 安全设备和个体防护
6.2.1.1 可能产生致病微生物气溶胶或出现溅出的操作均应在生物安全柜(II级生物安全柜为宜)或其他物理防护设备中进行，并使用个体防护设备。
6.2.1.2 处理高浓度或大容量感染性材料均必须在生物安全柜(II级生物安全柜为宜)或其他物理防护设备中进行，并使用个体防护设备。上述材料的离心操作如果使用密封的离心机转子或安全离心杯，则可在实验室中进行，但只能在生物安全柜中开闭和装载感染性材料，。
6.2.1.3 当微生物的操作不可能在生物安全柜内进行而必须采取外部操作时，为防止感染性材料溅出或雾化危害，必须使用面部保护装置(护目镜、面罩、个体呼吸保护用品或其他防溅出保护设备)。
6.2.1.4 在实验室中应穿着工作服或罩衫等防护服。离开实验室时，防护服必须脱下并留在实验室内。不得穿着外出，更不能携带回家。用过的工作服应先在实验室中消毒，然后统一洗涤或丢弃。
6.2.1.5 当手可能接触感染材料、污染的表面或设备时应戴手套。如可能发生感染性材料的溢出或溅出，宜戴两副手套。不得戴着手套离开实验室。工作完全结束后方可除去手套。一次性手套不得清洗和再次使用。
6.2.1.6 实验时，禁止他人进入实验室，或必须经实验室负责人同意后方可进入。免疫耐受或正在使用免疫抑制剂的工作人员必须经实验室负责人同意方可在实验室工作。
6.2.1.7 实验室入口处须贴上生物危险标志，注明危险因子、生物安全级别、需要的免疫、负责人姓名和电话、进入实验室的特殊要求及离开实验室的程序。
6.2.1.8 工作人员应接受必要的免疫接种和检测(如乙型肝炎疫苗、卡介苗等)。
6.2.1.9 必要时收集从事危险性工作人员的基本血清留底，并根据需要定期收集血清样本，应有检测报告，如有问题及时处理。
6.2.1.10 工作人员要接受有关的潜在危险知识的培训，掌握预防暴露以及暴露后的处理程序。每年要接受一次最新的培训。
6.2.1.11严格遵守下列规定，防止利器损伤：
6.2.1.11.1 除特殊情况(肠道外注射和静脉切开等)外，尽可能使用塑料器材代替玻璃器材。
6.2.1.11.2 尽可能应用一次性注射器，用过的针头禁止折弯、剪断、折断、重新盖帽、从注射器取下，禁止用手直接操作。用过的针头必须直接放人防穿透的容器中。非一次性利器必须放入厚壁容器中并运送到特定区域消毒，最好进行高压消毒。
6.2.1.11.3 尽可能使用无针注射器和其他安全装置。
6.2.1.11.4 禁止用手处理破碎的玻璃器具。装有污染针、利器及破碎玻璃的容器在丢弃之前必须消毒。
6.2.1.11.5 培养基、组织、体液及其他具有潜在危险性的废弃物须放在防漏的容器中储存、运输及消毒灭菌。
6.2.1.11.6 实验设备在运出修理或维护前必须进行消毒。
6.2.1.11.7 人员暴露于感染性物质时，及时向实验室负责人汇报，并记录事故经过和处理方案。
6.2.1.11.8 禁止将无关动物带入实验室。
6.2.2 特殊要求
6.2.2.1 应设置实施各种消毒方法的设施，如高压灭菌锅、化学消毒装置等对废弃物进行处理。
6.2.2.2 应设置洗眼装置。
6.2.2.3 实验室门宜带锁、可自动关闭。
6.2.2.4 实验室出口应有发光指示标志。
6.2.2.5 实验室宜有不少于每小时3～4次的通风换气次数。
6.3 生物安全等级Ⅲ级防护微生物菌种操作规程
6.3.1 安全设备和个体防护
6.3.1.1 实验室中必须安装Ⅱ级或Ⅱ级以上生物安全柜。
6.3.1.2 所有涉及感染性材料的操作应在生物安全柜中进行。当这类操作不得不在生物安全柜外进行时，必须采用个体防护与使用物理防护设备的综合防护措施。
6.3.1.3 在进行感染性组织培养、有可能产生感染性气溶胶的操作时，必须使用个体防护设备。
6.3.1.4 当不能安全有效地将气溶胶限定在一定范围内时，应使用呼吸保护装置。
6.3.1.5 工作人员在进入实验室工作区前，应在专用的更衣室(或缓冲间)穿着背开式工作服或其他防护服。工作完毕必须脱下工作服，不得穿工作服离开实验室。可再次使用的工作服必须先消毒后清洗。
6.3.1.6 工作时必须戴手套(两副为宜)。一次性手套必须先消毒后丢弃。
6.3.1.7 在实验室中必须配备有效的消毒剂、眼部清洗剂或生理盐水，且易于取用。可配备应急药品。 出实验室灭活的物品必须放在专用密闭容器内。
6.3.2 特殊要求
6.3.2.1 实验室的门必须关上。
6.3.2.2 进入实验室的工作人员必须经实验室负责人同意，禁止干扰正在操作或辅助的工作人员。禁止免疫耐受和正在使用免疫抑制剂的工作人员进入实验室；禁止临时有病或有皮肤破损者在实验室工作；禁止未成年人进入实验室。
6.3.2.3 实验室入口处必须贴上生物危险标志，注明危险因子、生物安全级别、需要的免疫、实验室负责人或其他相关负责人姓名和电话、进入实验室的特殊要求及离开实验室的程序。
6.3.2.4 建立严格的实验室规章制度，有关人员进入实验室时必须明确进入和离开实验室的程序。建立出入登记册制度。
6.3.2.5 工作人员应接受必要的免疫接种和检测(如乙肝疫苗、卡介苗)，并定期进行检查。
6.3.2.6 收集工作人员和其它风险人群的基本血清留底，以后根据需要定期收集血清样本，应有检测报告，如有问题及时处理。
6.3.2.7 将生物安全程序纳入实验室标准操作规范或生物安全手册，向所有工作人员提供生物安全手册。告知工作人员实验室的特殊危险，工作人员要阅读并按照规范的要求操作。
6.3.2.8 实验室及其辅助工作人员要接受有关的潜在危险知识的培训，掌握预防暴露以及暴露后的处理程序。每年要接受最新的培训。
6.3.2.9 在进入实验室之前，实验室负责人有责任向所有工作人员提供标准微生物学操作规范和技术，仪器操作规范。并由专家提供特殊培训。
6.3.2.10 实验所需物品必须经传递窗送入。
6.3.2.11 严格遵守下列规定，防止利器损伤：
6.3.2.11.1 除肠道外注射和静脉切开等特殊情况，严禁在实验室使用针、注射器及其他利器。尽可能用塑料器材取代玻璃器材。
6.3.2.11.2 注射和吸取感染性液体时必须用一次性注射器，用过的针头禁止折弯、折断、剪断、重新盖上帽、从注射器取下，禁止用手直接操作。应将其放在不锈钢容器中。非一次性利器必须放到厚壁容器中，运到特定区域消毒，最终进行高压消毒。
6.3.2.11.3 尽可能使用无针注射器和其他安全装置，装有污染的针、利器及破碎玻璃的容器在丢弃之前必须进行高压灭菌。禁止用手处理破碎的玻璃器具。
6.3.2.12 禁止在开放的实验台上和容器内进行感染性物质的操作，应在生物安全柜或其他物理设备中进行。生物安全柜内的工作台表面用适当的消毒剂清理。
6.3.2.13 培养基、组织、体液及其他废弃物必须放在防漏的容器中储存及运输。
6.3.2.14 感染性实验结束后，尤其在感染性物质溢出和溅出后，应由专业人员或经过正规培训的人员进行消毒和清理。实验室中必须备有溢出物处理程序的文件。
6.3.2.15 污染的设备在运出维修前必须消毒。所有废弃物或物品，在丢弃或重新使用前必须消毒。
6.3.2.16 建立实验室事故和暴露的报告系统。感染性物质溢出及暴露事故发生后，必须及时消毒处理，并向实验室负责人汇报，并记录事故过程和处理经过。
6.3.2.17 禁止将无关动植物带入实验室。
6.3.2.18 内外必须设置通讯系统，实验室内的实验记录等资料应通过传真机发送至实验室外。
6.4 生物安全等级Ⅳ级防护微生物菌种操作规程
6.4.1 安全设备和个体防护
6.4.1.1 在实验室中所有感染性材料的操作都必须在Ⅲ级生物安全柜中进行。如果工作人员穿着整体的由生命维持系统供气的正压工作服，则相关操作可在Ⅱ级生物安全柜中进行。
6.4.1.2 所有工作人员进入实验室时都必须换上全套实验室服装，包括内衣、内裤、衬衣或连衫裤、鞋和手套等。所有这些实验室保护服在淋浴和离开实验室前均必须在更衣室内脱下。
6.4.1.3 实验过程中非实验人员进入实验室须经实验室负责人批准。
6.4.1.4 制定尖锐器具的安全操作规程。
6.4.1.5 必须严格执行所有操作程序，减少或避免气溶胶的产生。
6.4.1.6 每次实验结束后，必须消毒工作台面，活性物质溅出及溢出后必须及时处理和消毒。
6.4.1.7 所有的废弃物在丢弃之前用适当的方法消毒，如高压消毒。
6.4.1.8 制定有效的防鼠、防虫措施。
6.4.2 特殊要求
6.4.2.1 禁止非工作人员、免疫耐受和免疫抑制的人员、儿童及孕妇进入实验室。临时有病(如上呼吸道感染等)的工作人员也禁止进入实验室。
6.4.2.2 实验室入口安装带锁的安全门，进入实验室由实验室负责人，生物安全负责人或设备安全负责人管理。进入实验室之前，工作人员必须了解实验室的潜在危险及正确的防护措施。
6.4.2.3 进入实验室的人员必须遵守进入和离开实验室的程序，记录进入和离开实验室的日期、时间及实验室状态。
6.4.2.4 建立有效的应急处理方法。
6.4.2.5 实验室入口处必须贴上生物危险标志，注明危险因子，实验室负责人姓名和进入实验室所需的特殊要求(如免疫和防毒面具等)。
6.4.2.6 实验室负责人保证工作人员熟知标准微生物和本实验室所研究微生物的操作规范和技术，掌握实验室设备的特殊规范和操作。
6.4.2.7 工作人员应接受有关致病因子的免疫接种。
6.4.2.8 收集检测工作人员的本底血清并留底，以后根据需要定期收集血清样本。建立血清学监测程序。
6.4.2.9 向工作人员提供生物安全手册，告知有关的特殊危险，要求其阅读并严格按照规范操作。
6.4.2.10 工作人员须接受有关的潜在危险知识培训、掌握预防暴露及暴露后的处理程序。定期接受最新的培训。
6.4.2.11 进入和离开实验室只能通过更衣室和淋浴室通道。只有在紧急情况下才可经气闸门应急通道离开实验室。
6.4.2.12 工作人员在外更衣室更换存放自己的衣服，进入实验室须在内更衣室洁净工作服间穿戴整套实验室工作服，包括内衣、裤子、衬衫、鞋、手套等。离开实验室必须淋浴，进入淋浴室前，在内更衣室非洁净工作服间脱掉衣服，衣服经高压消毒后清洗。
6.4.2.13 实验室所需物品经双门高压室，烟熏消毒室或气闸门送入。
6.4.2.14 严格遵守下列规定，防止利器损伤：
6.4.2.14.1 除肠道外注射等特殊情况，严禁在实验室使用针、注射器或其他利器。尽可能用塑料器材取代玻璃器材。
6.4.2.14.2 注射和抽取感染性液体时必须用一次性联体注射器，用过的针头禁止折弯、剪断、折断、重新盖上帽、从注射器取下，用手工操作。将针放在防穿透容器中，非一次性利器放入厚壁容器内运到特定区进行高压消毒。
6.4.2.14.3 尽可能使用无针注射器和其他安全装置。
6.4.2.14.4 禁止用手处理破碎的玻璃器具、装有污染的针，利器及破碎玻璃的容器在丢弃之前必须高压消毒。
6.4.2.15 从三级生物安全柜或四级生物安全实验室转移的生物学物质必须完整地转到不易破裂的密封一级容器内，再用二级容器包装，通过消毒液池和气闸门运出实验室。
6.4.2.16 除生物学物质须保持完整原始状态外，禁止从四级生物安全实验室取出没有经过高压消毒或烟熏消毒的物质。
6.4.2.17 感染性物质实验结束后，尤其在感染性物质溢出和溅出后，由专业人员或经过正规培训的人员进行消毒。仪器在运出修理和保养前要进行消毒。实验室中必须备有溢出物处理程序的文件。
6.4.2.18 建立实验室事故和暴露的报告系统，感染性物质溢出及暴露事故发生后，必须及时向实验室负责人汇报，并记录事故过程和处理经过。建立实验室感染人员的隔离和医疗护理机构。
6.4.2.19 禁止在实验室处理无关物品。
6.4.2.20 内外必须设置通讯系统，实验室内的实验记录等资料应通过传真机发送至实验室外。